S Hill-Reaktioen - Experimente Biologie

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S Hill-Reaktioen

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Nachweis des Elektronentransports                                                  zurück
bei der Photosynthese
Nach ihrem Entdecker Hill "Hill" Reaktionen genannt. 
Volker Schneider
Lit. http://de.wikipedia.org/wiki/Hill-Reaktion ;
http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/dv03/3_05.htm;
http://www.biologie-lk.de/showthread.php?t=21553 ;
Weiler, E. u. L. Nover (2017): Botanik, s.253ff (ausführlich)

Der Nachweis, dass bei der Photosynthese durch Licht chemische Substanzen reduziert werden, gelang dem Physiologen Hill 1942. Der natürliche Elektronenakzeptor NADP wurde erst 1956 nachgewiesen.
 
2 H2O   +   2 NADP+   + Licht → 2 NADPH+H+   +   O2 

Wir nutzen in diesem Versuch das Dichlorphenol-Indophenol als Elektronenakzeptor. Es hat den Vorteil, dass es bei der Reduktion die Farbe von Blau nach farblos wechselt. Die Farbänderung kann als quantitatives Maß für den Elektronentransport in Chloroplasten gewählt werden.
 
Diese Reaktion in Chlorplasten ist unabhängig vom Vorhandensein von CO2. Dies war der Nachweis, dass die Photosynthese aus mehreren Reaktionen besteht: Den Lichtreaktionen – die einen Elektronenakzeptor benötigen, und die Dunkelreaktionen, die CO2  benötigen.
Vereinfacht kann man die Hillreaktion aus heutiger Sicht wie folgt darstellen:

 
 
Um die Hill-Reaktion durchführen zu können, muss man zuerst funktionsfähige Chloroplasten aus dem Zellsaft isolieren.



Elektronentransport Arbeitsunterlage 1-----------------------------------------------------------------
Isolierung Chloroplasten und Überprüfung

Material: saubere Reagensgläser, Mixer, fertiger Phosphat-puffer pH 7,6;
 Wasser, Pipetten,
Diaprojektor oder starke Lampe mit Schirmabdeckung,
1gr Gramm Dichlorphenol-Indophenol (DCPIP) (Apotheke).
5 gr Ascorbinsäure (fest) (Apotheke)
Objekt: Spinatblätter, möglichst frisch ca 500 gr

Vorbereitung:
1: Spinatblätter säubern, Mittelrippen entfernen.
2: mit dem Phosphatpuffer mischen und 3 sek lang auf höchster Stufe mixen.
3: Flüssigkeit durch ein Sieb geben, dann durch 8 Lagen Gaze pressen. Es bleibt eine tief grüne Flüssigkeit.
4: Die Flüssigkeit auf 4 Grad kühlen und möglichst rasch zentrifugieren: Die noch intakten Chloroplasten senken sich am Boden ab.
5: Diese Choloplasten werden mit sehr wenig Wasser aufgenommen, indem man sie mehrfach durch eine 2 ml Pipette auf und nieder saugt.
6: Diese Chloroplastensuspension wird bei 4 Grad (Eisbad) aufbewahrt.

Versuch:
1: Der Diaprojektor oder die Lichtquelle wird im Abstand von etwa 50 cm aufgebaut.
2: Ein Reagenzglashalter steht in entsprechendem Abstand.




Kontrolle 1: Die Lösung darf sich nicht verfärben. - Wenn doch, sind weitere Redoxreaktionen beteiligt.  
Kontrolle 2: Die Lösung verfärbt sich schlagartig In hellgrün. Die Reduktion von DCPIP findet statt.

Test 
Der  Zeitbedarf muss ausgetestet werden. 
Die Chloroplastenmenge und die Lichtmenge sollten so gewählt werden, dass die Reaktion in 2 min erfolgt. 
 
Variationen des Versuchs: Abhängigkeit von Lichtintensität, von der Lichtqualität (Farbfolien), von der Chloroplastenkonzentration, von der Menge an DCPIP, von der Temperatur. 



Elektronentransport Arbeitsunterlage 2-----------------------------------------------------------------
Überprüfung der Testsubstanzen
 
Benötigte Substanzen: 
100mg DCPIP (Dichlorphenol-Indophenol) auf 100 ml Wasser , Wasser
Chloroplastensuspension,  Ascorbinsäure
 
Vorversuch:  Test mit Ascorbinsäure:
Ascorbinsäure (= Vitamin C) fungiert als Reduktionsmittel: Vitamin C gibt leicht Elektronen ab und reduziert andere Substanzen, wie z. B. Dichlorphenol-Indophenol:

 
 
Zur Überprüfung der Reaktion (Reduktion des blauen DCPIP zum farblosen Farbstoff (Leucofarbstoff) gibt man einige Körchen festes Vitamin C zu einem Teil der tiefblau gefärbten wässrigen DCPIP Lösung.
 
Farbumschlag in Wasser mit Ascorbin?  ___________
 
Farbumschlag in einem Teil der Chloroplastensuspension mit Ascorbin ?_______
 
Entfärbung der Chloroplastensuspension ohne Ascorbinsäure? ______
 
Wenn eine Entfärbung in 20min ohne Ascorbinsäurezusatz erfolgt, sind noch reduzierende Substanzen in der Suspension selbst enthalten. 
Man muss dann eine neue Chloroplastensuspension herstellen.
 
 

Elektronentransport Arbeitsunterlage 3-----------------------------------------------------------------
 Hill-Reaktion
 
Material: saubere Reagensgläser, Mixer, fertiger Phosphat-puffer, Wasser, Pipetten, Diaprojektor oder starke Lampe mit Schirmabdeckung,
wenige Gramm Dichlorphenol-Indophenol (DCPIP) (Apotheke).
Ascorbinsäure (fest) (Apotheke)

Objekt: Spinatblätter, möglichst frisch
Vorbereitung:
1: Spinatblätter säubern.
2: mit dem Phosphatpuffer mischen und 3 sek lang auf höchster Stufe mixen.
3: Flüssigkeit durch ein Sieb geben, dann durch 8 Lagen Gaze pressen. Es bleibt eine tief grüne Flüssigkeit.
4: Die Flüssigkeit auf 4 Grad kühlen und möglichst rasch zentrifugieren: Die noch intakten Chloroplasten senken sich am Boden ab.
5: Diese Choloplasten werden mit sehr wenig Wasser aufgenommen, indem man sie mehrfach durch eine 2 ml Pipette auf und nieder saugt.
6: Diese Chloroplastensuspension wird bei 4 Grad (Eisbad) aufbewahrt.
Versuch:
1: Der Diaprojektor oder die Lichtquelle wird im Abstand von etwa 50 cm aufgebaut.
2: Ein Reagenzglashalter steht in entsprechendem Abstand.
3: Man bereitet 3 Reagenzgläser vor und befüllt sie nach folgendem Muster: 
 
Beobachtung:.
 
 
Variationen des Versuchs: Abhängigkeit von Lichtintensität, von der Lichtqualität (Farbfolien), von der Chloroplastenkonzentration, von der Menge an DCPIP, von der Temperatur. 



Elektronentransport Arbeitsunterlage 4-----------------------------------------------------------------
 Hill Reaktion:  Abhängigkeit von der Lichtqualität

Benötigte Substanzen: 
100mg DCPIP auf 100 ml Wasser, Chloroplastensuspension (grün, durchscheinend) insgesamt etwa 40ml, Wasser, Ascorbinsäure
Geräte: Diaprojektor oder starke Lampe, Rahmenhalterung aus Pappe für die Filter, Magnetrührer, Reagenzgläser, Kühlwasser, 2 Magnetfischchen, verschiedene Plastikfolien in verschiedenen Farben (Bastelgeschäft)
Versuchsaufbau:
 
 

Messung: Abhängigkeit von der Lichtqualität (Blau-, Rot- und Grün Filter aus klarer Plastik, 18o C und 20.000 Lux)
Man bötigt immer 3 Reagenzgläser für 3 Ansätze mit genau gleichen Volumina
Tipp: Man nimmt soviel Chloroplastensuspension, dass eine Entfärbung im Vorversuch in etwa 3 min erfolgt. 
Dann kann man die gewünschten Variablen untersuchen. Ein Vergleich der Ergebnisse ist nur innerhalb einer Chloroplastensuspension möglich!

Muster für ein Protokoll:

 
Versuchsbedingungen: 
Mit dem Belichtungsmesser stellt man gleiche Lichtmengen her, indem man den Diaprojektor entsprechend verschiebt. 
Ergebnis: 


 
 
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