Sauerkraut - Experimente Biologie

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Sauerkraut

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Sauerkraut: Einführung                                               zurück  
Bakterien im Dienst des Menschen

Didaktischer Hintergrund: Der Versuch ist geeignet, vom einfachen, fast spielerischen Anfang über eine schon genauere Erfassung des Vorgangs hin zu einer wissenschaftlichen Erarbeitung im Bereich der Verfahrenstechnik in Art eines Spiralcurriculums zu gelangen. Dabei können je nach Gruppensituation die verschiedenen didaktischen Niveaus im Unterricht erreicht werden. 
Sachliche Grundlagen: Sauerkraut gilt im Volksmund als „Besen für den Darm“, es ist seit langer Zeit als Lieferant für Vitamin C bekannt. Sauerkraut entsteht durch die Wirkungsweise von Salz liebenden (halophilen) Milchsäurebakterien aus Weißkohl. Das Produkt ist Milchsäure, das die Bakterien in die Umgebung abgeben.  Diese ist nicht nur für die Konservierung sondern auch für den „sauren“ Geschmack des Krautes verantwortlich. Der hohe Vitamin C Gehalt und die lange Haltbarkeit, aber vor allem der charakteristische Geschmack machen das Sauerkraut zu einer auch heute sehr beliebten und gesunden Beilage. Schon im Römischen Reich wie auch im „alten China“ wurde Gemüse durch Milchsäuregärung eine längere Haltbarkeit verliehen. Vor allem im Winter beugte Sauerkraut wegen des hohen Vitamin C Gehalts von 20mg pro 100g  Mangelerscheinungen vor.
 
Die Sauerkrautherstellung gehörte früher zu den Pflichten einer Hausfrau bis die Nahrungsmittelindustrie die Herstellung übernommen hat.
Im hier vorgestellten Versuch wird nicht nur Sauerkraut selbst hergestellt, sondern auch eine Wachstumskinetik erarbeitet, die in die biotechnische Arbeitsweise einführen und diese verständlich machen kann
.
Tipps: Für rund 500g Sauerkraut benötigt man 1000g frischen Weißkohl, Ausreichend Kochsalz, einen irdenen Topf oder einen passenden Topf aus Edelstahl entsprechender Größe. Am Weißkohl selbst haften genügend viele Milchsäurebakterien. Nach dem Einstampfen tritt auf Grund des größeren osmotischen Drucks der Kochsalzlösung Wasser aus den Zellen aus, sie sterben ab. Ein mittlerer Pressdruck (per Faust) unterstützt den Vorgang. Man sollte aber die Hände vorher säubern. Das Kraut soll nun vollkommen von der Salz- Lake bedeckt sein. Um die noch vorhandenen Luftblasen lassen sich auspressen. Das Gärgefäß wird dann 7 Tage bei Raumtemperatur abgestellt.
Verwendet man kein Gärgefäß wie abgebildet, muss man nach einiger Zeit den Deckel anheben, damit das CO2 austreten kann. Nach 7 Tagen wird der Gärbehälter in eine Umgebung mit 10 - 15 °C (früher oft im Keller) gebracht. Dort soll das Sauerkraut mehrere Wochen reifen und für den Geschmack wichtige Aromastoffe bilden.
Die Fermentation: Für die Fermentation von Weißkohl zum Sauerkraut sind verschiedene Milchsäurebakterien verantwortlich, die bereits an den Blättern haften. Darunter finden sich Leuconostoc paramesentroides, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus sake und Lactobacillus curvatus. Gerade in den ersten Tagen der Fermentation spielt Leuconostoc mesenteroides eine übergeordnete Rolle. Die Milchsäurebakterien verstoffwechseln zunächst ohne Sauerstoff (anaerob), Neben Milchsäure werden zu Beginn auch Essigsäure und andere organische Säuren gebildet, die den Geschmack sehr negativ beeinträchtigen können. (
nach einem Unterrichtsversuch von Kai Kessler, Peter M. Kunz und Isabell Sommer, nicht veröffentlicht)
 
Die Reaktionsgleichungen:

 

Optimierung des Fermentationsprozesses: Bei einer Fermentation, wie der Herstellung von Sauerkraut, verstoffwechseln Mikroorganismen Substrate (Ausgangsstoffe) zu Produkten, wie in unserem Fall die Glucose zur Milchsäure. Sind die Organismen gut mit Substrat und einigen Spurenstoffen versorgt, nimmt das „Wachstum“ ständig zu (Abb.1 Phase a) bis zum optimalen Wachstum (Abb.1 Phase b). Vereinfachend spricht man von Wachstum, gemeint ist die Zunahme der Bakterienmenge oder die Zunahme des Produkts, messbar als Gewichtszunahme des Produkts oder als Trübungszunahme in der Suspension als Zeichen für die zunehmende Menge an Bakterien. Die Erfassung der Geschwindigkeit der Umsetzung möglichst einfach analysieren zu können, ist ein wichtiges Anliegen der Verfahrenstechnik. Damit kann nämlich die Effektivität des Prozesses ermittelt und durch entsprechende Maßnahmen optimiert und kostengünstiger gestaltet werden. Dieses Verfahren kann an der Sauerkrautherstellung exemplarisch erarbeitet werden. 


Wissenschaftlicher Hintergrund: Die Theorie von Michaelis und Menten nimmt für den Ablauf der Enzymreaktion zwei Reaktionsschritte an. Diese Theorie hat sich bis heute bewährt. Dieses Verfahren gilt auch für Multienzymprozesse in ganzen Lebewesen. Für ein einzelnes Enzym gelten folgende Reaktionen: Dabei ist:
 

Die Reaktionsgeschwindigkeit ist dann optimal, wenn die Mengen an freiem Enzym E und an gebundenem Enyzm ES gleich sind. Man kann die Reaktionsgeschwindigkeit Km oder die Umsetzungsrate als ein Kriterium für das betreffende Enzym wählen: Je kleiner Km ist, um so höher ist die Umsetzungsgeschwindigkeit des Enzyms unter bestimmten Bedingungen. In der Verfahrenstechnik ist also die Bestimmung von Km ein interessanter Wert, um Anhaltspunkte für die Optimierung des Prozesses zu gewinnen.  
Bei der experimentellen Bestimmung von Km gibt es allerdings Schwierigkeiten: Wenn man im Experiment die Substratmenge ständig erhöht, wird immer mehr Enzymsubstratkomplex gebildet, bis alles Enzym im Komplex gebunden ist. Dann ist die Geschwindigkeit der Umsetzung optimal. Die Kurve der Geschwindigkeit verläuft fast horizontal. Diese maximale Geschwindigkeit ist allerdings experimentell nur ungenau zu bestimmen. Michaelis und Menten haben daher vorgeschlagen; V = 1/2max als Km  zu wählen (vgl. Abbildung 1). Hier ist die Messung sehr genau. Diese Konstante heißt nach den Entwicklern der Enzym-Theorie Michaelis-Menten-
          
Konstante (= Ks) : V1/2max  =  Km
Abb.1: Einfluss der Substratmenge auf die Geschwindigkeit der Enzymreaktion    
Abb. 2: Auftrag 1/ S gegen 1 /V, wobei V = Geschwindigkeit der Reaktion, S = Substrat (nach Lineweaver-Burk) bei einem gewählten Beispiel
 
Km  hat die Dimension einer Konzentration (mol / 1000ml). Sie gibt die Konzentration an Substrat an, die vorhanden sein muss, um die Hälfte der Enzyme zu sättigen. Das heißt: je geringer Km, umso aktiver das Enzym.  Lineweaver und Burk haben eine weitere Vereinfachung vorgeschlagen, nach der heute die meisten  Messungen durchgeführt werden: Trägt man die reziproken Werte von Vmax und S in einer Grafik auf, so ergibt sich eine Gerade für die Abhängigkeit der
Der Beweis kann mathematisch geführt werden. (Vgl. dazu:http://de.wikipedia.org/
http://www.uni-protokolle.de/Lexikon/Michaelis-Menten-Theorie.html
http://de.wikipedia.org/wiki/Datei:Lineweaver-Burke_plot.svg
)
 
Versuche:    Überprüfung der Sauerkrautherstellung   Km konstante aus Sauerkrautsaft   Km Konstante genau
 
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH: http://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/DSMZ_Medium11.pdf   (Stand: 16.05.09)
Dols et al (1997): Energetics of Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299 during Metabolism of Various Sugars and Their Consequences for Dextransucrase Production, American Society for Microbiology;  Kessler, K, Kunz. P.M. und I. Sommer (2010): Die Fermentation von Sauerkraut, IN: Bio.
Unserer Zeit, 123ff: Kurzhals, H.A: (neuste Auflage): Lexikon Lebensmitteltechnik, S.488,  Behr´s Verlag;  Praeve et.al.: (neueste Auflage): Handbuch der Biotechnologie, 4Aufl,S 482), Oldenbourg Industrieverlag; Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach §35 LMBG: Lebensmitteln IN: http://www.bfr.bund.de/cd/1600  (15/07/2010) ;  Allgemeine Informationen: http://de.wikipedia.org/wiki/Sauerkraut   15/07/2010.


 
Sauerkraut  Arbeitsunterlage 1 -------------------------------------------------------
Wie man den Ablauf der Sauerkrautentstehung überprüfen kann.
 
1) Der pH-Wert: Einen ersten Hinweis auf die Aktivität der Mikroorganismen liefert der pH-Wert. Man nimmt einen Streifen ph-Papier und träufelt mit einem Glasstab einen Tropfen der Lake auf. Die Farbänderung zeigt den pH-Wert an. Der sollte allmählich unter pH 4.0 sinken. Der Gehalt an Milchsäure liegt bei einem guten Sauerkraut bei 2%. 

2) Gasproduktion: Man nimmt eine Flasche, fügt der Lake etwas Weisskohl zu, gibt einen Löffel Zucker zu. 
Die Flasche wird mit einem Luftballon (Spielzeugzubehör) verschlossen. Nach einiger Zeit sollte sich der 
Luftballon aufblähen. 

3) Zuckertest. Der Zuckergehalt der Lake muss ständig abnehmen, wenn die Bakterien richtig arbeiten. Mit Hilfe eines Zuckermessstäbchens (Apotheke) kann man das überprüfen.  Der Zuckergehalt ist aber schon zu Beginn sehr gering. Führe eine Kontrolle mit einer 1%igen Glucoselösung durch!
 
4) Messung der Bakterienzunahme:
·         Man gibt etwas Lake auf einen Objektträger und verstreicht den Tropfen mit einem zweiten Objektträger möglichst gleichmäßig.
·         Nun zieht man den Objektträger mit der Tropfenseite nach oben wenige Male durch eine Kerzenflamme.
·         Nach der Zugabe von einem Tropfen Methylenblau und Abspülen mit Wasser sollten blau gefärbte, tote Hefezellen sichtbar werden.
     
·         Kontrolle: Bakterien aus dem Zahnbelag, nach der gleichen Methode angefärbt. (   vgl. Zahnhygiene) 
 



Sauerkraut Arbeitsunterlage 2 -------------------------------------------------------
Bestimmung des Ks Konstanten aus Sauerkraut-Lake

Trübungsmessung:
Wachstumsverhalten eines Sauerkraut-Bakteriums im Zeitverlauf, gemessen als
Trübung der Suspension.
 
Der blaue Bereich gibt      
den Bereich des optimalen
Wachstums µ max an.
 Trübungsmessung: 
Wachstumsverhalten der  
Sauerkraut-Bakterien im
Zeitverlauf, gemessen als
Trübung der Suspension.
 
Der blaue Bereich gibt
den Bereich des optimalen
Wachstums µ max an.
 Trübung der Suspension im Zeitverlauf


Aufgaben:
1.    Tragen Sie die von Ihnen gefundenen
Verläufe in einer anderen Farbe
in obigen Graf ein!

2.    Bestimmen Sie zwei µmax / 2 am 
Anfang und am Ende des
exponentiellen Verlaufs (blauer
Bereich in Abb. 1);

3.    Bestimmen Sie Ks nach der
Methode von Lineweaver-Burg!


 
Abb. 2: Bestimmung von KS
 
Vergleichen Sie den gefundenen Wert mit dem Wert aus der Literatur!
Literaturwerte: Für eine Reinkultur eines Bakteriums ergab sich ein µmax von 0,48 g/h und ein KS von 0,29 mol/L (oder 52,25 g/L umgerechnet mit der Molmasse der Glucose). Dies bedeutet, dass die BTM (=Biotrockenmasse ) einen Zuwachs von 0,48g pro Stunde zu verzeichnen hat, bei ausreichend hoher Glucose-Konzentration. Unter aeroben Bedingungen wird ein Ks von 0,6g/Std erreicht. Für den Stoffwechsel mit Saccharose eine Ks von 0,9g/Std.
 
Worauf führen Sie die Unterschiede in den Ks Werten zurück?


 
Sauerkraut Arbeitsunterlage 3 -------------------------------------------------------
Genauere Bestimmung der  Monod- Konstanten:
Projekt

Material:
3 Stück 250ml Kolben
Beheizbare Schüttelplatte
Stickstoff zum Verdrängen des Sauerstoffs aus den Kolben
Waage für das Ansetzen der Nährlösung
Glucose 1x 2,5 g für 10g/1000ml
Glucose 1x 12, 5 g für Konzentration 50g/1000ml
Verschiedene Pipetten
Destilliertes Wasser
Zentrifugenröhchen
Wiegeschälchen
Trockenwaare
Photometer und Küvetten für die Trübungsmessung
 
Nährlösung:
Pepton aus Casein                    10.0 g
Fleischextrakt                            10.0 g
Hefeextrakt                                  5.0 g
Kaliumhydrogenphosphat            2 g
Twen 80                                       1 g
Natriumacetat                               5 g
Ammoniumnitrat                           2 g
Magnesiumsulfat                          0.2 g
Mangansulfat                                0,o5 g
Dest. Wasser                                               1000ml
:
 
Arbeitsablauf:
1.    Nährlösung: die angesetzte Nährlösung wird auf drei 250 ml Erlenmeyer-Kolben verteilt und im Dampfkochtopf 20min sterilisiert.
2.    30g Glucose in Kolben1 auflösen. 
3.    2ml gereinigte Sauerkraut-Lake zugeben.
4.    Einleiten von Stickstoff bis der Sauerstoff aus der Lösung verdrängt ist.
5.    Mit Alufolie verschließen und bei 30 o über Nacht schütteln. 

6.    Am nächsten Tag In Kolben2 10g Glucose lösen. 

7.    In Kolben3 50g Glucose lösen. 
8.    In Kolben 2 und 3 je 30g Suspension aus Kolben1 einrühren.  
9.    Kolben 2 und 3 bei 30 o mehrere Stunden unter Rühren fermentieren lassen.  

Trübung alle 2 Std. bei 600µm messen.  Die Trübung sollte zu Beginn bei 1000 liegen 
(im Vergleich zur Extinktion der Lösung in Kolben1 bei 0,00)
 
 
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